Analyse funktioneller Hirnverbindungen mittels in vivo Optogenetik und Holographie
Die Beziehung zwischen Funktion und Vernetzung in kortikalen Schaltkreisen waren lange Gegenstand neurowissenschaftlicher Untersuchungen. Obwohl seit Jahrzehnten die Hauptwege kortikaler Informationsverarbeitung primärer sensorischer Areale beschrieben werden, ist weiter unklar, wie die Stimulusselektivität mit der Stärke der synaptischen Konnektivität innerhalb und zwischen den kortikalen Laminae zusammenhängt. Kürzlich gab es Hinweise für eine Korrelation zwischen der Wahrscheinlichkeit horizontaler exzitatorischer Verbindungen und der Stimulus¬präferenz in den Schichten 2/3 und V1 in der Maus. Um zu überprüfen, in welchem Ausmaße solche funktionellen horizontalen und vertikalen Verbindungen wirklich korrelieren, müssen wir die Möglichkeit schaffen, dreidimensional (3D) mit zellulärer optischer Auflösung und ms zeitlicher Präzision Zellen anzuregen und die Aktivität vieler Zellen auszulesen.
Der klassische Ansatz, zur Verbindungskartierung Mikroelektroden zu insertieren kann nicht für hunderte von Neuronen in vivo realisiert werden. Um die Patch-Elektroden durch Licht zu ersetzen, liefern jüngere Entwicklungen in der Optogenetik mit den relevanten molekularen und optischen Verbesserungen vielversprechende Lösungen, um kortikale Vernetzungen mit der geforderten räumlichen und zeitlichen Auflösung zu studieren. Im vorgeschlagenen Projekt wollen wir die Verbindungsmuster und die damit verbundene visuelle Prozessierung im V1-Bereich des Mausgehirns durch Verbindung der Expertise der beiden Partnerteams studieren, d.h. Wellenfront-Schärfungsmethoden des Emiliani-Labors und die Entwicklung optogenetischer Aktuatoren des Hegemann-Labors.
Unser holographischer Lichtmuster-Ansatz hat die Möglichkeit zur in vivo Generierung von Aktionspotentialen (APs) über Zweiphotonen(2P)-anregung erschlossen. Die Verwendung von ins Soma gesteuerter Opsine sichert Einzelzell-spezifische Anregung. Zur ms-genauen AP Anregung in neuronalen Lagen L2/3, L4m und L5 in vivo, werden wir die optischen und molekularen Parameter zur 2P-Anregung und Bildverarbeitung bis zu 1 mm Tiefe unter der Hirnoberfläche verbessern. Zum Einsatz einer Opsin-Anregung/Auslese-Kombination mit minimalen spektralem Überlapp werden wir anwendungsoptimierte Opsine mit angepassten Spektren, Kinetiken und Ionenselektivitäten zum Einsatz bringen und diese mit genetisch kodierbaren Ca2+- und Spannungs-indikatoren anregungstechnisch über unser neuestes 3D-Linienschärfungssystem verbinden. Um den Lichtintensitätsverlust durch Gewebestreuung zu minimieren, werden wir zeitliche und lokalstrukturierte Lichtmusterung und Infrarot-sensitive Rhodopsinen verwenden.
Um die frühere indirekte Korrelation von in vivo Anregung mit stark verzögerter Musteranalyse zu überwinden, sollen im vorgeschlagenen Projekt sowohl Anregung als auch die Aktivitäts-Analyse in vivo erfolgen.
Bei sequentieller Bewegung holographischer Belichtungsflecken über die kortikalen Schichten hinweg werden wir horizontale und vertikale Verbindungen mit stark verbesserter Präzision analysieren. Der Hauptvorteil unserer holographischen Methode ist die Generierung einzelner präsynaptischer APs und die Analyse postsynaptischer Verbindungen basierend auf einzelnen postsynaptischen EPSPs. Die Aktivitätsauslesung erfolgt zusätzlich über Spannungsindikatoren, die zu einem „All-optical-Mapping“ führen, das zu einem vertieften Verständnis der Signaltransduktion auf kortikalem zellulären Niveau führt
Mittelgeber
DFG Sachbeihilfe
Laufzeit
Projektstart: 11/2020
Projektende: 06/2025
Forschungsbereiche
Biophysik, Naturwissenschaften
