DFG-Sachbeihilfe: Energietransfer bei erzwungener Interkalation: Responsive und zugleich helle DNA-basierte Hochleistungssonden für die RNA-Visualisierung in lebenden Zellen

Fluorogene Hybridisierungssonden erlauben es, RNA-Moleküle und RNA-Transport in lebenden Wildtypzellen in Echtzeit zu visualisieren. Leistungsfähige Sonden erfahren bei Bindung an die Ziel-RNA eine deutliche Intensivierung der Fluoreszenzemission. Eine zentrale Rolle bei der bildgebenden Analyse spielt jedoch auch die Helligkeit der Sonden, durch die das Signal-Rausch-Verhältnis bestimmt wird. Der Herausforderung, Responsivität und Helligkeit einer Hybridisierungssonde gleichzeitig zu steigern, wurde bislang nicht begegnet. Im Gegenteil, meist wurden bei der Entwicklung von fluorogenen Hybridierungssonden zusätzliche Löschkanäle installiert. Es ist ein Ziel dieser Arbeit, das Imaging gering abundanter RNA zu ermöglichen. Hierzu werden fluorogene Hybridisierungssonden entwickelt, die hohe Responsivität mit einer gesteigerten Helligkeit verbinden. Weitere Ziele sind, für eine gleichzeitige Visualisierung verschiedener RNA-Targets die Palette verfügbarer Farben zu erweitern und von einer nur qualitativen Bildgebung zu einer quantitativen Expressionsanalyse in lebenden Zellen zu gelangen und somit RNA-Moleküle „zählen“ zu können. Um diese Ziele zu erreichen, werden wir neuartige DNA-basierte FIT-Sonden entwickeln. In diesen werden Cyaninfarbstoffe der Thiazolorange(TO)-Familie als fluorogenes Surrogat einer Nukleobase erzwungen interkaliert. Die Einführung von Locked Nucleic Acid (LNA) verfestigt das Rückgrat in der Umgebung des Farbstoffs. In der Folge erhöht sich die Fluoreszenzquantenausbeute, da verbesserte Basenstapelwechselwirkungen die Torsionsfreiheitsgrade um eine Cyaninmethingruppe einschränken. Zusätzliche, geringfügig bathochrom verschobene Cyaninfarbstoffe interagieren synergistisch und führen aufgrund der spektralen Überlappung der Absorptionsspektren zu einer weiteren Erhöhung der Helligkeit. Ohne neue Fluorophore einbeziehen zu müssen, werden wir sowohl die Helligkeit als auch die Palette verfügbarer Farben erhöhen. Hierfür entwickeln wir ein Tag-Repeat-System, bei dem die benachbarte Hybridisierung verschiedenfarbiger FIT-Sonden das Farbspektrum durch FRET erweitert. Für das quantitative RNA Imaging wird FIT-DNA mit einem zusätzlichen NIR-Fluorophor ausgestattet, dessen Fluoreszenz bei Stoßkontakt mit dem TO-Nukleotid nicht gelöscht wird. Die Emission des NIR-Reporters liefert daher Informationen über die Konzentration der Sonde. Die TO-Emission dient als Hybridierungsreporter. Die leistungsfähigen Hybridisierungssonden werden das Imaging von wenig abundanter mRNA in der Frühphase der Influenzainfektion erlauben. Hierbei werden bis zu drei verschiedene mRNA-Moleküle gleichzeitig visualisiert. Es interessiert vor allem die zeitliche Staffelung der Lokalisierung in den Nukleoli während der Infektion. In einer weiteren Zusammenarbeit wird der Transport von oskar mRNA in sich entwickelnden Oocyten von Drosophila charakterisiert. Hier werden sowohl DNA- als auch PNA-basierte FIT-Sonden über Mikroinjektion eingebracht und der Einfluss des Sondenrückgrats (ionisch vs. nicht-ionisch) auf die Lokalisierungsexperimente erkundet.