SPP 1784: Zelluläre Bildgebung der RNA-C-zu-U-Editierung


Die RNA-Editierung beeinflusst das RNA-Spleißen und die Proteintranslation. Die jüngsten Fortschritte in der Hochdurchsatz-RNA-Sequenzierung haben eine zunehmende Anzahl an mRNA-Editierungsstellen offenlegen können. Diese Methoden erbringen einen Überblick über den Editierstatus eines Ensembles an Zellen. Hingegen ist über die Dynamik, Zellspezifität und Regulation der mRNA-Editierung wenig bekannt. Auch ist unklar, ob die Lokalisation der RNA durch Editierung beeinflusst wird. Diese Wissenslücken sind auf das Fehlen geeigneter Methoden zur Echtzeit-RNA-Analyse in Zellen zurückzuführen, denn die gebräuchlichen RNA-Bildgebungsverfahren bieten nicht die Sequenzspezifität und Sensitivität, die für eine Bildgebung editierter RNA nötig wäre. Um die methodologische Lücke zu schließen, werden wir fluorogene Oligonukleotid-Sonden entwickeln, die ein Fluoreszenzsignal nur dann liefern, wenn die Hybridisierung mit matched (z.B. editierter) mRNA, nicht aber mit mismatched (z.B. nicht editierter) mRNA stattfindet. Wir werden auf Forced Intercalation (FIT)-Sonden zurückgreifen. In diesen nimmt ein Farbstoff aus der Thiazolorange (TO)-Familie die Stelle einer kanonischen Nukleobase ein. FIT-Sonden liefern bei Hybridisierung einzelnukleotidspezifische Anstiege der Fluoreszenzemission. Für eine eineindeutige Typisierung des RNA-Editierzustands wird eine FIT-Sonde den editierten Zustand (z.B. GlyR α2 c.656U) abfragen, während eine zweite konkurrierende und unterschiedlich farbige FIT-Sonde den nicht editierten Zustand (z.B. GlyR α2 c.656C) anzeigt. Durch zusätzlicher Farbstoffe und Helfersonden werden wir die Sequenzspezifität und das Ansprechverhalten weiter verbessern. Homo-Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET) werden wir nutzen, um fehlpaarungssensitive Energiesenken einzuführen. Hetero-FRET mit TO-ähnlichen Farbstoffen wird bei breitbandiger Anregung die Helligkeit der Signale erhöhen. Die hier untersuchte C→U-Editierung der mRNA für den Glycin-Neurotransmitterrezeptor (GlyR) bewirkt einen Funktionszugewinn des Proteins und kann zu kognitiver Dysfunktion und Angstverhalten führen. Unsere Studien legen nahe, dass dies jedoch vom Nervenzelltyp abhängt, in dem die RNA-Editierung hochreguliert ist. Ziel ist es also, die Dynamik und mögliche Nervenzelltypspezifität der Editierung von mRNA für den GlyR zu erfassen. Hierfür werden wir die Visualisierung der GlyR-RNA-Editierung mit immunchemischen Methoden zur Nervenzelltypbestimmung und funktionellen Analysen auf Einzelzellniveau kombinieren. Nach anfänglichen Untersuchungen an fixierten Primärneuronen, in denen Epitop-markierte GlyR-mRNA (HA und MS2 oder BOTO) in editierter und nicht editierter Form exprimiert wird, werden wir neuronal-endogene GlyR-kodierende RNA in fixierten und lebenden Primärkulturen des Hippokampus sowie in Hirnschnittpräparaten vom Tiermodell der Epilepsie nachweisen. Die vorgeschlagenen Arbeiten werden funktionale Studien zur Regulation der RNA-Editierungsmaschinerie ermöglichen.


Projektleitung
Seitz, Oliver Prof. Dr. rer. nat. (Details) (Organische und Bioorganische Chemie III)

Beteiligte externe Organisationen

Laufzeit
Projektstart: 01/2016
Projektende: 06/2019

Forschungsbereiche
Biologische und Biomimetische Chemie

Zuletzt aktualisiert 2021-14-09 um 15:09