Different Sensitivity of Selected Planktonic Eukaryotic and Prokaryotic Phototrophs to Dissolved Humic Substances: Potential Modes of Action and Ecological Implication


Mehrfach ungesättigte, langkettige Fettsäuren (LC-PUFA) sind wichtige Zellbestandteile in Membranen und dienen als Vorstufen für eine biologisch hoch aktive Gruppe von Signalmolekülen, den Eicosanoiden. Ziel dieses Projekts ist die Aufklärung der Rolle von Cytochrom P450 (CYP)-abhängigen Eicosanoiden bei der Regulation der Pharynxaktivität des Nematoden Caenorhabditis elegans. Wir postulieren, dass die Bildung der CYP-33E2-abhängigen Eicosanoide in den Marginalzellen des Pharynx als Antwort auf die Ausschüttung von spezifischen Transmittern durch die benachbarten neuronalen Zellen erfolgt. Die gebildeten CYP-Eicosanoide wirken dann parakrin auf die Kontraktilität der benachbarten Muskelzellen. Aus physiologischer Sicht könnte dieser Mechanismus zur Feinabstimmung des Fressverhaltens dienen. Zur Prüfung unserer Hypothesen wollen wir im ersten Teil des Projekts zunächst untersuchen, welchen Effekt die einzelnen von CYP-33E2 erzeugten LC-PUFA-Metabolite auf die Pharynxaktivität haben. Im zweiten Teil soll analysiert werden, für welche der bekannten Neurotransmitter die CYP-Eicosanoide tatsächlich als sekundäre Botenstoffe fungieren. Schwerpunkt des dritten Teils wird dann die Identifizierung von G-Protein-gekoppelten-Membranrezeptoren (GPCR) sein, die als mögliche primäre Targets der CYP-Eicosanoide fungieren. Der grundlegende Versuchsaufbau des ersten und zweiten Teils besteht in einer Kurzzeit-Behandlung von adulten Nematoden mit verschiedenen Eicosanoiden als auch Neurotransmittern und einer anschließenden Bestimmung der Pharynxaktivität am Binokular (Pumpfrequenz) als auch mittels eines Fütterungstests mit fluoreszierenden Polystyrolpartikeln (Aufnahmetest). Mit Hilfe von Ca2+-bindenden Cameleon-Konstrukten wird am konfokalen Lasermikroskop eine mögliche Beeinflussung der rhythmischen Ca2+-Oszillation in den aktiven pharyngalen Muskel-zellen untersucht. Für die Experimente sollen sowohl ad libitum gefütterte als auch gehungerte adulte Nematoden unterschiedlichen Alters aus Synchronkulturen sowie Tiere, deren Eicosanoidproduktion blockiert worden ist, eingesetzt werden. Schlussendlich wird über LC-MS/MS bestimmt, inwiefern Modulationen der Pharynxaktivität bzw. die Behandlung mit Neurotransmittern in vivo von einer Veränderung des freien Eicosanoidmusters begleitet sind. Die Hemmung der Expression des verantwortlichen Rezeptors durch RNA-Interferenz (RNAi) sollte zu einem Ausfall des Effekts von ausgewählten CYP-Eicosanoiden auf die Pharynxaktivität führen. Darauf basierend wollen wir im dritten Teil ein Screening durchführen, bei dem alle aus dem Genom von C. elegans bekannten GPCRs auf ihre potentielle Rolle als Vermittler des Pumpfrequenz-verändernden Effekts von CYP-Eicosanoiden getestet werden. Der Versuchs-aufbau besteht in einer Synchronisation von L1-Larven des RNAi-hypersensitiven Stammes rrf-3(pk1426), der Fütterung der entsprechenden dsRNA produzierenden Escherichia coli Bakterien, dem Umsetzen von adulten Tieren, der kurzzeitigen Zugabe von CYP-Eicosanoid (plus je-weils einer parallelen Kontrolle ohne Exposition) und einer finalen Zufütterung der Fluoreszenz-markierten Beads. Die primäre Auswertung des Tests besteht im Vergleich der inkorporierten Fluoreszenz mit bzw. ohne Eicosanoid-Exposition, positive Kandidaten werden weiter überprüft. Aus evolutionärer Sicht könnte der Pharynx von C. elegans ein Modell für die Entwicklung von CYP-Eicosanoid-abhängigen Signalwegen darstellen. Ein mögliches Gegenstück zur Rolle von CYP-33E2 bei der Regulation der Pharynxaktivität von C. elegans könnte die Funktion von CYP2C und CYP2J Isoformen bei der Regulation der Kontraktilität von Gefäß- bzw. Herzmuskelzellen bei Säugern sein. Die Identität der CYP-Eicosanoid-Rezeptoren ist dabei eine zentrale und bisher ungelöste Frage der gesamten Forschung auf dem Gebiet der CYP-Eicosanoide. Die Verwendung von C. elegans als Modelorganismus bietet einen neuartigen experimentellen Zugang zur Beantwortung dieser Frage.


Principal Investigators
Menzel, Ralph PD Dr. (Details) (Ecology)

Duration of Project
Start date: 01/2012
End date: 12/2014

Publications
Kosel, M., Wild, W., Bell, A., Rothe, M., Lindschau, C, Steinberg, C.E.W., Schunck, W.-H., Menzel, R. (2011) Eicosanoid formation by a cytochrome P450 isoform expressed in the pharynx of Caenorhabditis elegans. Biochemical Journal 435, 689-700.

Last updated on 2020-02-12 at 12:28