Aufbau und Funktion des Typ-III Proteinexportsystems des bakteriellen Flagellums

Viele Bakterien, wie Salmonella Typhimurium, nutzen die Rotation des Flagellums um sich in verschiedenen Umgebungen gerichtet zu bewegen. Das Flagellum besteht aus drei Hauptbestandteilen: einem Basalkörper, einem gebeugten Adapterstück und einem langen Filament. Das Flagellum von Bakterien ist funktional und strukturell mit dem Virulenz-assoziierten Injektisomsystem von pathogenen Bakterien verwandt. Beide Systeme nutzen ein Typ-III Sekretionssystem (T3SS) um den Export von Substratproteinen in Abhängigkeit des Protonengradienten zu energetisieren. Der Proteinexport via T3SS ist essenziell für den Aufbau des Flagellums, des Injektisomsystem, sowie für die Sekretion von Effektorproteinen. Die Kernkomponenten des Exportapparats bestehen aus einem cytoplasmatischen ATPase-Komplex, sowie sechs Membranproteinen, welche den Protonengradienten für die Sekretion von Substratproteinen nutzen. Ein Verständnis des Mechanismus der Proteinsekretion auf molekularer Ebene ist allerdings nicht vorhanden. Es wird angenommen, dass ein Komplex aus den Membranproteinen FliOPQR den Sekretionskanal des T3SS des Flagellums bildet. Diese Proteine sind essentiell für die Funktion des T3SS und Aufbau des Flagellums. Jedoch fehlen weitergehende Informationen bezüglich der Stöchiometrie des Komplexes, der Orientierung der Transmembrandomänen, Interaktionen zwischen Untereinheiten, sowie der molekularen Funktion des Proteintransports. Das Membranprotein FliP ist die meistkonservierte Komponente des T3SS. Auf Grundlage von vorläufigen Daten und bio-informatischen Analysen ist unsere Arbeitshypothese, dass Oligomere von FliP den Proteinsekretionskanal des T3SS bilden. Das Ziel dieses Projekts ist es die molekulare Funktion von FliP mit Hilfe einer synergistischen Kombination von Bioinformatik, Genetik und Biochemie aufzuklären. Wir werden zunächst eine Cysteinmutagenesestrategie benutzen, um die Orientierung von Sekundärstrukturelementen von FliP zu bestimmen. Anschließend werden wir biochemische und elektronentomographische Ansätze benutzen, um Interaktionen und die sub-zelluläre Lokalisation von Proteindomänen innerhalb des T3SS Proteinsekretionskanals zu bestimmen. In einem komplementären Ansatz werden wir unterstützend verschiedene Mutagenesestrategien verwenden, um die Funktion des FliP Komplexes zu untersuchen. Diese Informationen werden es uns ermöglichen ein strukturelles Modell des FliP Sekretionskanals iterativ zu verbessern mit dem Ziel ein pseudo-atomares Modell des T3SS Kernkomplex zu generieren. Zusammenfassend werden wir durch die Erkenntnisse dieses Projekts ein mechanistisches Verständnis bezüglich der Funktion des bakteriellen T3SS und des Aufbaus von Multiproteinkomplexen erhalten.