Dynamik der Untereinheiteninteraktionen in ECF-Transportern

"Energy-coupling factor (ECF)"-Transporter enthalten ein substratspezifisches (S) und ein moderat konserviertes (T) integrales Membranprotein sowie ABC-ATPasen (A). Im Gegensatz zu kanonischen ABC-Importern besitzen sie keine extryzytoplasmatischen Substratbindeproteine. Die oligomere Zusammensetzung aus A-, T- und S-Komponenten, die exakten Rollen der S- und T-Einheiten sowie die molekularen Mechanismen, die die Hydrolyse von ATP mit Bewegungen in den Transporterkomplexen zur Substrattranslokalisation koppeln, sind umstritten bzw. unbekannt. Während die Kristallstrukturen dreier S-Einheiten monomere Formen mit gebundenem Substrat zeigen, deuten in vivo-Analysen, Mutagenesestudien und Quervernetzungsexperimente auf oligomere Zustände der S- und möglicherweise auch der T-Einheiten als funktionelle Zustände hin. Schwerpunkt des Vorhabens werden Biotin-Transporter (BioYMN) sein. Unsere bisherigen Ergebnisse favorisieren einen dimeren Zustand von BioY als der funktionellen S-Einheit, die auch als alleinige Komponente nicht nur Substratbinde-, sondern zusätzlich Transportfunktion besitzt. Diese kontrovers diskutierte Interpretation der vorliegenden Daten soll mit Hilfe eines geeigneten Reporterstamms von E. coli und mehreren BioY-Homologen als Objekten im in vivo-System eindeutig geklärt werden. Die oligomeren Zustände der T-Einheit BioN und von BioY werden mit fluoreszenzspektroskopischen und –mikroskopischen Verfahren in lebenden Zellen und nach Rekonstitution gereinigter Transporterkomplexe in Nano-Discs analysiert. Komplementär wird dieser Aspekt mit EPR-Analysen spinmarkierter Komplexe in Nano-Discs verfolgt. Die Dynamik der Untereinheiten während des ATP-Hydrolysezyklus wird durch kinetische Analysen, "Pull-down"- und EPR-Experimente untersucht. Eine strukturbiologische Zusammenarbeit verfolgt das Ziel, die Raumstruktur eines ECF-Holotransporters aufzuklären und damit direkte Hinweise auf die Anordnung der Untereinheiten im Komplex zu erhalten.

Projektleitung
Eitinger, Thomas Prof. Dr. rer. nat. (Details) (Mikrobiologie)

Mittelgeber
DFG: Sachbeihilfe

Laufzeit
Projektstart: 01/2014
Projektende: 12/2016

Publikationen
Finkenwirth, F., F. Kirsch and T. Eitinger. 2017. Complex stability during the transport cycle of a subclass I ECF transporter. Biochemistry 56:4578-4583.

Finkenwirth, F., M. Sippach, H. Landmesser, F. Kirsch, A. Ogienko, M. Grunzel, C. Kiesler, H.-J. Steinhoff, E. Schneider and T. Eitinger. 2015. ATP-dependent conformational changes trigger substrate capture and release by an ECF-type biotin transporter. Journal of Biological Chemistry 290:16929-16942.

Kirsch, F. and T. Eitinger. 2014. Transport of nickel and cobalt ions into bacterial cells by S components of ECF transporters. BioMetals 27:653-660.

Yu, Y., M. Zhou, F. Kirsch, C. Xu, L. Zhang, Y. Wang, Z. Jiang, N. Wang, J. Li, T. Eitinger and M. Yang. 2014. Planar substrate binding site dictates the specificity of ECF-type nickel/cobalt transporters. Cell Research 24:267-277.

Zuletzt aktualisiert 2020-01-06 um 17:28